I. Introduction
Les logiciels que nous allons utiliser
sont majoritairement issus de la suite EMBOSS (EMBOSS
homepage). Ils sont disponible à plusieurs endroits :
Ces logiciels peuvent présenter 2 interfaces différentes, l'une basée sur Pise comme à l'institut Pasteur, l'autre basée sur EMBOSS Explorer comme au centre de bioinformatique de Wageningen. Dans les deux cas, vous devez saisir :
- votre email ;
- vos données (le plus souvent au format FASTA) ;
- les paramètres du programme.
Dans les interfaces basées sur Pise, en cliquant sur le nom du
programme (en haut à gauche) vous aurez des informations sur ce
qu'il fait et sur les paramètres. Dans celles basées sur EMBOSS
Explorer, vous obtenez l'aide en suivant le lien read 'the
manual'.
Pour chacun des logiciels, il existe deux interfaces, l'une
simple, l'autre dite avancée. Dans la version simple, seuls
quelques paramètres peuvent être modifiés, les autres étant
choisis par défaut. Nous utiliserons systématiquement la version
avancée.
Vous devrez stocker des séquences et des résultats dans des
fichiers. Pour ce faire, vous aurez simplement à enregistrer ces
fichiers grâce aux menus de votre navigateur.
II. Recherches avec le dotplot et les outils d'alignement
II-1. Premiers tests
Nous allons principalement utiliser tout au long de ce TP les 4
logiciels suivants : dotpath,
dotmatcher, stretcher et
matcher. Nous vous conseillons d'ouvrir un logiciel
par onglet de votre navigateur et ne les fermer qu'à la fin du TP.
Nous allons utiliser deux logiciels pour
effectuer les dotplots :
- dotpath qui permet de dessiner un dotplot avec
une taille de fenêtre fixée (param.=windowsize) ;
- dotmatcher qui permet de filtrer les fenêtres
avec un seuil (param.=threshold).
Et les deux autres pour les alignements :
- stretcher pour l'alignement global ;
- matcher pour l'alignement local.
Choississez le serveur sur lequel vous allez utiliser ces logiciels.
Regardez les différentes interfaces.
Où sont les informations sur chaque logiciel ?
En quelle langue ?
Comment passer du mode simple au mode avancé ?
Quelles sont les options qu'on peut modifier ?
Préparer votre navigateur pour l'utilisation de ces 4 logiciels.
II-2. Introns / exons
Essayer le logiciel dotpath
avec la taille de fenêtre par défaut et en sélectionnant
l'option 'Display the overlapping matches'. Essayer avec
d'autres tailles de fenêtre.
En déselectionnant l'option 'Display the overlapping
matches', vous demandez au logiciel de ne conserver que les
fenêtres non chevauchantes. Observez le résultat avec 4 comme
taille de fenêtre.
Que constatez-vous ?
En fait, la première séquence est l'ADN d'un
gène de l'actine chez Xenopus laevis et la seconde l'ADNc de ce
même gène.
Combien le gène compte-t-il d'exons ?
Essayer le logiciel
dotmatcher avec les paramètres par
défaut. Faites varier le paramètre de seuil jusqu'à retrouver le
résultat obtenu avec dotpath.
Les matrices disponibles dans EMBOSS se trouvent
ici.
Jouez sur le paramètre de la matrice de
score et observez le résultat.
Le seuil, ou threshold, en paramètre de
dotmatcher correspond au score d'alignement au delà duquel la fenêtre
est affichée. C'est pour cela qu'en faisant varier les matrices on
obtient des dotplots différents.
Pour repérer exactement les sites d'épissage,
faites un alignement global de ces deux séquences avec
stretcher. Testez ce logiciel en fixant comme
pénalité d'ouverture de gap 12 et comme pénalité d'extension de gap
1.
Que retrouvez-vous ?
À quelles positions se trouvent les introns et
les exons ?
Cela est-il cohérent avec les données contenues
dans EMBL ?
II-3. Séquence nucléique / séquence protéique
Nous allonst maintenant aborder un exemple
chez l'homme et la souris : les séquences nucléiques et protéiques
des gènes pl6.
Construisez le dotplot des séquences ADN puis
le dotplot des séquences protéiques avec
dotmatcher.
Sur quel type de séquence la similarité
est-elle la plus visible ?
Comparez maintenant les séquences avec
l'algorithme d'alignement global stretcher en utilisant les paramètres par défaut.
Notez les pourcentage de similarité dans chaque cas.
Sur quel type de séquence la similarité
est-elle la plus visible ?
Conclusion ?
II-4. Conservation de domaine
Vous allez maintenant comparer deux autres
séquences: ce sont deux facteurs de transcription
krox 24 et
sp1, contenus dans les fichiers
krox24.seq et
sp1.seq.
Construisez un dotplot avec
dotmatcher de ces deux séquences.
Vous devez observer une similitude locale :
c'est un motif doigt de zinc, impliqué dans la liaison à l'ADN.
Comparez ensuite les deux séquences avec un
alignement local en utilisant matcher. Retrouver le
résultat précédent.
Retrouvez dans les banques de données les
fiches de ces deux séquences et vérifiez les bornes exactes des motifs
doigt de zinc dans chacune d'elle.
II-5. Analyse d'une séquence
Le dotplot peut également être utilisé pour
étudier les régularités structurelles d'une séquence. Vous allez
tester cette approche sur les deux exemples suivants.
1. Localisation de répétitions :
Analysez avec
dotpath la
séquence de rétrotransposon de tabac contenue dans le fichier
ben2.seqn (activez l'option 'Display the
overlapping matches').
En jouant sur le
paramètre de taille de fenêtre, identifiez le nombre de répétitions
significatives ?
Coupez votre séquence en deux tel que chaque
moitié contienne une répétition. Faite un alignement local avec
matcher de ces 2 moitiés pour identifiez plus
précisément le motif répété.
En vous aidant de la littérature présente dans
la fiche EMBL de cette séquence, pouvez-vous suggérer quel est ce motif
répété ?
2. Faible complexité :
Pour illustrer la présence de régions de
faible complexité, nous allons étudier la séquence contenue dans le
fichier
falciparum.seq avec
dotmatcher. En faisant varier les paramètres, vous
devez observer quatre tâches.
À quoi cela correspond-il ?
II-6. Programmation dynamique live
Vous pouvez jeter un coup d'oeil sur
ce
site web. Il permet de réaliser un calcul d'alignement local, de
visualiser la matrice de programmation dynamique et le backtracking.
Changez les séquences et les paramètres, par
exemple reprenez les données de l'exercice 2 du TD1.
III. Significativité des scores
Le logiciel prss permet
de tester la significativité entre deux séquences. Il
crée une séquence aléatoire de même composition que la seconde
séquence fournie et effectue un algorithme d'alignement. Il répète
cela plusieurs fois.
Vous pouvez
utiliser ce logiciel sur un des deux serveurs suivants :
-
prss à l'université de Virginie ;
- prss
sur le noeud Suisse EMBnet, où on obtient en plus une vue graphique de
la distribution des scores.
Allez chercher dans une banque deux séquences
protéiques de longueurs similaires et qui n'ont a priori rien à
voir. Testez prss avec ces deux séquences.
Pour lire le résultat, il faut trouver le
score d'alignement entre les 2 séquences, généralement en dessous de
s-w (pour smith-waterman) et le nombre attendu de
fois où le score d'alignement avec une séquence mélangée dépasse ce
score, généralement pas loin, en dessous de E(nombre).
Lorsqu'on a la distribution graphique des scores, on peut voir si le
score s-w de nos 2 séquences se situe dans le coeur
de cette distribution ou pas.
Le résultat est-il celui attendu ?
Refaites le même test mais avec deux
séquences proches (par exemple avec les séquences protéiques d'homme
et de souris de l'
exercice II-3).
IV. Enzymes TPP (Thiamine Phosphate dependent enzymes)
Afin d'avoir une idée de la ressemblance
entre ces séquences, effectuez un dotplot avec
dotpath.
IV-1. Pénalités associées aux gaps
Effectuez un alignement global avec le
logiciel stretcher en prenant comme paramètres :
pénalité d'ouverture de gap = 2, pénalité d'extension de gap = 2,
matrice de scores = EPAM60.
Enregistrez le fichier résultat et retenez la
valeur du score et du % d'identité (ou plus simplement laissez cet
onglet ouvert et effectuez la prochaine recherche dans un autre
onglet). Observez le scénario évolutif qui serait nécessaire pour
que cet alignement soit le bon.
L'alignement obtenu est spécifique aux
valeurs de paramètres, en particulier au fait que nous sommes dans le
cadre d'une fonction de gap linéaire.
Effectuez maintenant un alignement global
avec le logiciel stretcher en prenant comme
paramètres : pénalité d'ouverture de gap = 12, pénalité d'extension de
gap = 2, matrice de scores = pam60. Comparez le résultat avec
l'alignement précédent.
Quelles différences remarquez-vous ?
Quelle est celui des deux alignements qui vous paraît le plus
pertinent ?
Nous voyons ici l'effet des fonctions de
gaps. D'autre part, cela met en évidence qu'un alignement de meilleur
score n'est pas forcément le meilleur alignement entre deux
séquences.
IV-2. Matrices de score
Les séquences précédentes (ILV1_TOBAC et
ILVB_ARATH) sont de la famille des enzymes Thiamine Pyrophosphate
(TPP). PDC1 est également de cette famille mais plus éloignée.
Effectuez un alignement global entre
ILVB_ARATH et PDC1_MAIZE avec stretcher avec comme
paramètres : matrice=EBLOSUM62, ouverture de gap=12, extension de
gap=2.
Remarquez combien le score de cet alignement et
le pourcentage d'identité sont faibles.
Pensez-vous que ce soit
un bon alignement ?
Pensez-vous que la matrice BLOSUM62 soit
adéquat dans ce cadre ?
Quelle matrice pourrait être meilleure
? Pourquoi ?
Refaites cet alignement avec une matrice
que vous pensez être meilleure. (
Les matrices disponibles dans EMBOSS se trouvent ici)
Qu'en pensez-vous ?
Essayons avec les matrices PAM.
Construisez les alignements avec EPAM30 et EPAM350.
Quel est le meilleur alignement ?
Était-ce
prévisible ?
En confrontant les résultats de
l'alignement avec les structures secondaires, on dispose d'un critère
de décision supplémentaire pour juger de la validité d'un
alignement.
Il faut retenir que les matrices de scores affectent les résultats
d'un alignement et qu'il est difficile de juger de la qualité d'un
alignement de deux séquences. Le choix de la matrice dépend de la
divergence qu'on les deux séquences étudiées, les meilleurs résultats
étant obtenus lorsque on utilise la matrice la plus sensible par
rapport au niveau de divergence réel des séquences.
IV-3. Alignement local (facultatif)
Les alignements locaux sont souvent plus
utiles que les alignements globaux. Les séquences proches partagent le
plus souvent des régions similaires et non leur totalité.
Nous allons tenter d'identifier si un
fragment inconnu de protéine est relatif aux trois protéines
précédentes ILVB_ARATH, ILV1_TOBAC et DPC1_MAIZE.
Effectuez un alignement global avec
stretcher entre ce peptide et ILV1_TOBAC avec comme
paramètres la matrice de score EBLOSUM45 et le jeu de pénalités de gaps
12/2.
Que pensez-vous de cet alignement ?
Comment expliquez-vous ce résultat ?
Faites maintenant un alignement local avec
matcher avec les mêmes paramètres. Choisissez de voir
les 10 meilleurs alignements locaux (paramètre 'Number of alternative matches').
Afin de vérifier si ces alignements locaux
sont pertinents, nous allons utiliser la base de données BLOCKS (
http://blocks.fhcrc.org). Cette
base contient des fragments similaires à certaines protéines. C'est à
partir de ceux-ci que les matrices BLOSUM sont construites.
Surfez un peu sur le site de
BLOCKS.
Recherchez si il y a un bloc correspondant aux séquences que nous
traitons (pensez à regarder leur numéro d'accession).
Normalement vous devez trouver 2 blocs
référencés IPB011766 et IPB000399.
Recherchez si il y a des fragments
correspondants aux alignements locaux trouvés plus haut dans IPB000399.
